在微生物实验研究中，人与微生物之间最常用的隔离屏障是“生物安全柜”，作为一级隔离屏障，生物安全柜已被大量应用于生物安全实验室。伴随人类对微生物研究的不断深化，生物安全柜的安全防护性能也获得了同步发展和不断技术进步。生物安全柜的安全防护性能直接影响到实验室的安全，尤其是一些重要的P3、P4实验室。随我国产业发展，生物安全柜的应用领域正不断扩展，现成为基因工程、生物细胞、医疗器械、制药等产业领域的必要装备。生物安全柜的安全性能如何满足扩展应用领域的需要已成为一项新的课题。本文就目前执行的YY0569《Ⅱ级生物安全柜》标准为基础，论述其安全性能的提高空间。

一、YY0569的局限性

上世纪70年代生物安全柜因微生物实验研究而诞生。最初，生物安全柜仅作用于实验人员的保护。当人们认识到微生物实验中样本保护的重要性后，生物安全柜的操作舱就有了垂直层流和洁净气流的概念。最后形成定义：生物安全柜是一个负压通风过滤的箱型操作柜。

与暴露的实验操作相比较，Ⅱ级生物安全柜已将人员污染风险概率降到了1×10^-5。

基因工程、生物细胞等新兴产业领域期望生物安全柜性能获得持续改善，以满足：

1.整个操作舱成为样本受保护的空间范围，现有技术中存在“不受保护区域范围”，生物细胞实验操作中易发生样本污染事件。

2.持续改善操作舱内部的洁净度等级，并要求相对≧0.5μm直径当量的气溶胶计数上限≦100颗粒/m³。

3.洁净度检测的采样点分布调整为距离操作舱内侧壁30mm的边界处，现有技术中100mm边界条件导致样本受保护区域范围过小，样本污染风险概率过高。

4.正压污染高效空气过滤器与柜体密封结合处应保证无泄漏。现有技术生物安全柜不能避免基因污染，因为基因片段远小于0.3μm。

二、应用领域提出安全性能新要求

整合新兴产业领域要求，Ⅱ级生物安全柜技术性能持续改善的项目包括：

1. Ⅱ级生物安全柜“零泄漏”安全保护功能

高效空气过滤器的透过率是可控的，所有安装于生物安全柜的过滤器都经过严格的检测。所谓零泄漏，是对过滤器与柜体间的一种密封要求。所有要求样本受保护的应用场合不希望操作舱内存在泄漏的悬浮颗粒物。ⅡA2生物安全柜的排风泄漏具有更高的风险危害性，排风气流是输送于房间环境内的，这将导致实验室污染和人员污染事件的发生。

注：美国Nuaire公司公开了一种静电吸附气溶胶颗粒的专利技术，该专利被应用于生物安全柜过滤器与柜体间的“零泄漏”安全保护。

2. 洁净度提高到3级（@0.3μm直径当量颗粒）

现有技术的100级或GMP规范中A级所述的洁净度等级都关注0.5μm直径当量颗粒，颗粒计数上限3520/m³，相对0.3μm颗粒的计数上限可能高达10176.25/m³。这样的空气质量仍然具有细胞样本被污染的高风险概率。

持续改善安全柜操作舱洁净度的切入技术主要包括两方面:

a. 物理方法杜绝颗粒物泄漏于操作舱内。“零泄漏”技术提供了实现的条件。

b. 物理方法消除悬浮颗粒物滞留的条件。高效过滤器有效虑芯面积全覆盖操作舱横截面是一项有效措施。

关注颗粒直径当量的基点落在0.3μm是必要的。已知细菌颗粒的直径当量范围约0.5μm~5.0μm，更能有效消除细菌侵入细胞组织的几率。

3. 颗粒物计数采样点分布于距离操作舱内侧壁30mm处。

这是检测方法范畴的考虑。目的是验证操作舱整体范围内满足样本保护的能力。

三、零泄漏、气流盲区与净化等级的关联分析

操作舱气流盲区，即“不受保护的区域范围”是下降气流过滤器有效面积小于操作舱横截面所致。操作舱中心区域因大量垂直下降的洁净气流而构成样本“受保护区域范围”。操作舱周边的气流盲区构成“不受保护区域范围”。因气流盲区沿操作舱内壁四周呈立体状存在，所以不受保护范围是一个立体空间范围。

在小区域空气净化环境内气流盲区是影响该区域空气洁净等级的重要因素，生物安全柜操作舱的洁净等级受制于舱内净面积与高效空气过滤器的有效截面的比值，比值为1时，无菌作业环境达到最优的设计等级。安全柜操作舱提供高等级无菌环境得益于消除气流盲区技术的实现。

样本被污染的机理分析：

热璧效应危害：

操作舱是一个气流场与温度场并存的空间。照明灯与风机电机发散的热促成了热璧效应特性。操作台面向上直至散流板的各横截面高度呈现不同温度，顶部区域温度最高，构成了气流盲区内悬浮颗粒上升的物理条件。实验操作中人员动作与器械移动形成的干扰气流使悬浮颗粒位移进入气流盲区，温度效应使悬浮颗粒沿璧板上移。气流盲区内，特别是顶部的气流漩涡使悬浮颗粒滞留。当气流漩涡中的颗粒物又随边界气流下降时，样本被污染的事件就会发生。

气流模式缺陷：

Ⅱ级生物安全柜气流模式的符合性也是受保护区域范围的重要因素。气流模式的薄弱环节突出暴露于距离前窗玻璃内侧25mm且高于额定前窗开启高度150mm水平方向的项目检测中。因为操作舱顶部前沿有一个不可避免的气流盲区。又因气流下降过程的扩散能力是有限的，最大扩散角不超过10度，所以柜体前部倾斜设计的安全柜更甚。可视烟雾在气流模式检测中常有烟雾向上反流情况发生，说明该区域范围内悬浮颗粒物不能完全被台面前沿的格栅吸收而构成样本污染的风险概率。

四、操作舱内部结构设计措施

下降气流高效空气过滤器有效面积与操作舱横截面的面积比设计技术（Design Technology of area ratio 简称：ARD）是消除样本被污染风险概率的主要设计对策措施。“零泄漏”设计技术（Zero leakage design technology 简称：ZLD）是消除样本（及实验室环境、人员）被污染风险概率的第二对策措施。ARD+ZLD综合设计技术运用于ⅡA2生物安全柜可满足对样本污染特别敏感场合的应用。

a.ARD消除了操作舱左、右、后三侧气流盲区，提供了垂直向下洁净空气的气流活塞效应条件；

b.ZLD完全截断了正压污染静压箱内气溶胶颗粒物泄漏于操作舱内或气溶胶颗粒物泄漏于房间空气环境的通路；

注1：除非ⅡA2生物安全柜通过管道将排风气流输送于大气层，通常ⅡA2的排风气流是输送在实验室房间内，应特别关注安全柜排风泄漏的可能性，一旦泄漏事件形成，污染物将暴露于房间空间，房间环境污染和人员都将面临污染危害。

c. 垂直下降气流高效空气过滤器出风面与位于操作舱顶部空气散流板间建立气流引导设计，使气流得以扩散至操作舱顶部前沿，整个操作舱实现了被洁净气流的覆盖。

五、设计成效验证

用高效空气过滤器扫描检漏、颗粒物计数检测两个方法验证。

a.气溶胶光度计扫描检漏

零泄漏被指高效空气过滤器与柜体的密封结合处，扫描检漏中关注高效过滤器与操作舱顶部的结合处。按YY0569或美国NSF49给出的方法验证。

b.颗粒物计数检测（洁净度等级）

关注0.3μm直径当量颗粒的洁净度。微生物细菌颗粒的直径当量一般是在0.5μm至5μm范围内，考核0.3μm直径当量颗粒是向无菌操作环境提供安全柜技术能力的保证，也是安全柜性能与高效空气过滤器配置技术要求的一致。

检测验证按GB/T 25915.1—ISO 14644-1的规定执行。

采样点分布：

在操作舱后侧壁与左右侧壁30mm等距相交的点，设置两个采样点；在距离前窗玻璃内侧100mm与距离左右侧壁30mm相交的点，设置两个采样点；分别在对角相交的两个采样点中心设置1个采样点，共5个采样点。采样高度为台面向上300mm空间（与气流流速采样高度一致）。

3级@0.3μm颗粒计数上限值：

按GB/T 25915.1—ISO 14644-1标准，每立方空气中0.3μm颗粒的计数上限由下式算出：

式中：n——计数颗粒上限值；

      N——洁净度等级：3；

      0.1——常数；

      d——关注粒径（d=0.3），关注粒径允许多个，可分别按公式计算。

计算结果：n=101.7625053颗粒/m³，修约为102颗粒/m³。

最小采样量：

规定最小采样量是检测结果置信度的需要。按单位体积内气溶胶均匀分布原则，将采集到20颗粒所需的空气体积为最小采样量。由下式算出：

计算结果：3级@0.3μm的最小采样量196.536升，取整数200L。

采样速率：

采样速率由最小采样量决定。GB/T 25915.1—ISO 14644-1要求采样量大于2升时，光散射粒子计数器的采样速率至少28L/min。

采样结果：

6台生物安全柜的采样结果见下表：  

六、结论

Ⅱ级生物安全柜的ARD+ZLD综合设计技术提高了操作舱洁净度等级,表1显示：4个直径当量的颗粒均处于GB25915.1-ISO14644-1中最高等级的浓度下限。ARD的“垂直向下洁净空气的气流活塞效应”、ZLD的“截断正压污染气溶胶颗粒物泄漏通路”在生物安全柜中的综合设计满足了样本污染特别敏感的生物细胞实验与研究、植入人体医疗器械、制药等领域的应用，并向GMP提供了最具保证能力的无菌作业工艺装备。

(责任编辑：刘悦)