体外安全性评价目前主要有针对皮肤刺激性评价、眼刺激性/腐蚀性评价、致敏性评价、光毒性评价。下文分别从上述四个方面介绍相应的评价方法。

　　一、皮肤刺激性评价

　　皮肤刺激性是指皮肤接触受试物后产生的局部可逆性损伤。目前体外替代试验主要有重组人表皮模型试验，该方法目前已经经过了经济合作与发展组织（OECD）、欧洲替代方法验证中心（ECVAM）的验证与认可。

　　人表皮模型主要是将由人体取得的角质形成细胞在体外诱导培养，完全分化至具有多层皮肤结构的三维人体表皮模型。经过验证的主要有EpiSkin、EpiDermTM、SkinEthicTM、LabCyte EPI-MODEL24 SIT四种模型，将受试物涂抹于皮肤模型，暴露一定时间后用MTT法测试细胞存活率，若细胞存活率大于50%，则该物质对皮肤无刺激；若细胞存活率小于等于50%，则该物质有皮肤刺激性，但无法对刺激性进一步分类。

　　二、眼刺激性/腐蚀性评价

　　在某些情况下，眼睛可能成为化妆品及其成分作用的靶器官或吸收途径，从而引起眼刺激/腐蚀，故眼刺激/腐蚀性的评价是化妆品及其成分安全性评价的必要内容。至今，已有多种动物替代试验的体外方法被开发和应用。接下来主要对以下三种方法进行介绍。

　　1、兔眼角膜上皮细胞短时暴露试验（STE）

　　化学物质引起的严重眼损伤/眼刺激，主要表现为角膜混浊、虹膜炎、结膜发红、结膜化脓等。细胞损伤有多种方式发生，包括：细胞膜裂解、大分子（特别是蛋白质）的凝固、脂类的皂化、与大分子的烷基化或其他共价相互作用等。化学物质对眼睛的严重损害、刺激程度主要取决于初始损伤的程度，轻度刺激物一般只影响角膜浅表上皮，轻度和中度刺激物主要损伤角膜上皮和浅表基质，重度刺激物损伤角膜上皮、深层基质，有时也损伤角膜内皮。

　　传统检测眼刺激性/腐蚀性的实验是由Draize等提出的兔眼实验，目前仍是测定急性眼独行的国际标准。近年来，在动物福利和压力下，替代试验相继被提出并应用。2019年3月，国家药品监督管理局将化妆品用化学原料体外兔角膜上皮细胞短时暴露试验方法纳入《化妆品安全技术规范》（2015年版）。

　　该方法的原理主要是，化合物直接作用于角膜引起的刺激作用类似于细胞毒性损伤作用，通过检测细胞毒性指标，可反映角膜损伤的程度。试验采用体外培养的兔角膜上皮细胞（SIRC），短时暴露于化妆品用化学原料，模拟急性角膜刺激作用，通过计算细胞相对存活率来预测化妆品用化学原料引起的眼睛损伤。

　   2、重组人角膜（3D角膜）上皮模型试验

　　正常人的角膜上皮组织由5~6层分化的外胚层细胞组成，保护角膜并构成其视觉特性。3D角膜上皮模型是一种模拟角膜上皮和结膜损伤的分层上皮组织，可用检测中度到极轻度范围内的眼刺激物。用于构建角膜模型的上皮细胞来源于新生儿包皮角质细胞的原代培养物，与角膜上皮非常相似。

　　该方法的原理主要是，无论组织损伤的物理化学过程如何，细胞毒性在一种化学物质对眼睛的整体严重损害/刺激反应过程中起着重要的作用。组织活力的检测选取的方法为MTT法。MTT（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide，噻唑蓝）是一种外源性细胞染料，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。本方法利用体外重组3D角膜模型测试化学物质改变组织活力的能力，从而预测化学物质的潜在眼刺激性。

　　3、鸡胚绒毛尿囊膜抗刺激试验（HET-CAM）

　　受精鸡胚的绒毛尿囊膜被认为是模拟物质对眼结膜组织作用的合适模型，由于绒毛尿囊膜血管与人眼结膜血管组成较为相似，而人体粘膜，如眼结膜、嘴唇、鼻腔等，对外界刺激的敏感度远远大于皮肤的敏感度，尤其是人眼结膜的敏感度最高，所以目前鸡胚绒毛尿囊膜被普遍使用。

　　鸡胚绒毛尿囊膜抗刺激试验最早开发于1985年，经过了多次改进。目前国内有行业标准即中华人民共和国出入境检验检疫行业标准《化妆品眼刺激性/腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验》。同时，欧洲替代方法认证中心也提供了HET-CAM方法，且该方法已经通过替代方法确认协调委员会和机构间毒理学替代方法评价协调委员会评估研究，这两个方法的主要不同之处在于刺激评价上。欧盟替代中心方法除了要计算鸡胚测试的平均的IS值，还要测试每种待测物质出现刺激的临界浓度。

　　随着国内化妆品行业的不断进步，《化妆品安全技术规范》在保持科学性、先进性和规范性的基础上，充分借鉴国际化妆品质量安全控制技术和经验，全面反映了国内当前化妆品行业的发展和检验检测技术的提高，有助于促进化妆品行业健康发展，为提升我国化妆品技术规范权威性和国际影响力等发挥重要作用。

　　三、皮肤致敏性评价

　　过敏性接触性皮炎（Allergic Contact Dermatitis,ACD）是皮肤重复接触某种物质后机体产生的免疫介导的皮肤反应。人体的反应通常表现为红斑、瘙痒、丘疹等。皮肤致敏筛查是化妆品安全评价的重要内容。由于皮肤致敏的机制复杂，很难采用一个体外测试体系反映整个致敏过程的变化。因此，2006年至2008年经过系列预测毒理学会议讨论，学术界提出了有害结局通路（Adverse Outcome Pathway,AOP）的概念，并且在皮肤致敏过程中得到应用。

　　AOP是将现有的方法和系统生物学联系起来，收集和评估相关化学、生物学和毒理学信息，为化学物毒性预测和法规决策提供一个框架，其覆盖了化学物质的基本性质、分子间相互作用、细胞效应、器官效应、机体效应和群体效应阶段。根据皮肤致敏的发生机制，皮肤致敏AOP包括了4个关键事件：起始事件是内源性蛋白与半抗原共价结合；第二个关键事件是角质细胞反应，此过程角质细胞发生炎性反应并启动特定细胞通路基因的表达；第三个关键事件是树突状细胞反应，这一过程中LC将抗原传递给T细胞，促发T细胞增殖；第四个关键事件是抗原特异性T细胞活化与增殖。

　　基于该AOP框架建立的直接多肽结合试验（Direct Peptide Reactivity Assay,DPRA）和角质细胞ARE-Nrf2荧光素酶检测方法（KeratinoSens TM）、人细胞系活化试验(Human Cell Line Activation Test,h-CLAT)以及U937细胞系活化试验（U937 Cell Line Activation Test,U-SENS）已于近两年被OECD认可为标准方法。

　　1、DPRA试验

　　DPRA试验是针对皮肤致敏有害结局通路中的分子起始时间开发的一种体外化学分析方法。在皮肤致敏的发生过程中，化学物质与皮肤组织蛋白质的结合是一个关键步骤。大多数化学致敏原都是亲电性的，能与氨基酸的亲核中心发生结合反应。DPRA试验通过受试物与特征多肽共同孵育，采用HPLC分析反应液中多肽的损耗，以评估受试物的肽反应性。通过方法建立的预测模型，评估化学物质是否可能是皮肤致敏原。

　  2、KeratinoSens TM试验

　　KeratinoSens TM是一个基于转染了选择性质粒的人角质形成细胞（HaCaT）作为检测系统的方法。通过定量检测由Keap1-Nrf2-ARE反应通路激活引起的荧光素酶基因表达情况，作为皮肤致敏的反应量化指标。

　　3、h-CLAT试验

　　皮肤致敏的诱导阶段，朗格汉斯细胞（LC）起着呈递和修饰抗原、启动免疫反应的作用。当LC捕获抗原后，分化、成熟和迁移至局部淋巴结，将抗原传递给T细胞，促发T细胞的增殖。在这个过程中，LC活化成熟表现在于Ⅱ型组织相容性复合物（MHCⅡ）、共刺激分子（CD86、CD54、CD80和CD40）表达上调，细胞表面标志CD86、CD54和CD40以及炎性因子TNF-α和IL-8能够在诱导后的THP-1细胞中或培养液中检测到。

　　皮肤致敏试验（Human cell line activation test，h-CLAT），利用与LC功能类似的细胞——人急性单核细胞（THP-1细胞）建立检测方法，通过细胞表面特征标志物CD54和CD86的改变来对物质潜在的致敏性进行预测。

　   4、U-SENS试验

　　U-SENS试验使用人体骨髓细胞系U937细胞，与测试物接触45h后定量检测细胞表面标志物CD86表达的变化。CD86为U937细胞激活反应的特异性标志物，同时是一种共刺激分子，可模拟DC细胞激活引起T细胞增殖的关键步骤。对细胞进行异硫氰酸荧光素标记抗体染色后，用流式细胞仪检测CD86表达的变化。计算测试物与溶剂或空白对照相比CD86的相对荧光强度，通过预测模型预测致敏物与非致敏物。

　　四、皮肤光毒性评价

　　皮肤光毒性是指皮肤一次接触化学物质后，继而暴露于长波紫外线照射下所引发的一种皮肤毒性反应。传统的皮肤光毒性试验以动物实验为主，自20世纪80年代以来，光毒性的体外替代试验得到快速发展，体外3T3中性红摄取光毒性试验于2008年在国内被转化为国家标准（GB/T21769-2008），2016年11月，原国家食品药品监督管理总局将化妆品用化学原料体外3T3中性红摄取光毒性试验方法纳入《化妆品安全技术规范》（2015年版）。

　　该方法的原理主要是，光毒性是指应用于机体的物质经暴露于光线后诱发或增强（在低剂量水平时明显）的毒性反应，或全身应用一种物质后由皮肤光照引起的反应。中性红是一种弱的阳离子染料，极易以非离子扩散的方式穿透细胞膜并在细胞溶酶体内聚集。某些化学物质和外界条件作用可引起细胞表面或溶酶体膜敏感性的改变导致溶酶体脆性增高等不可逆的细胞毒性变化，从而导致细胞吸收中性红的能力下降。本试验方法通过测定3T3成纤维细胞经化学物质和紫外线照射联合作用后细胞吸收中性红的能力或细胞毒性的变化来判断该化学物质是否具有光毒性。该方法已经成为世界范围内化妆品、化学品等实验室评价光毒性的标准方法之一，用于化学品监管、化妆品原料测试和科学研究。

　　随着新《化妆品监督管理条例》的实施，国家对化妆品的监管力度加大，对于化妆品及相关原料的安全风险评估显得尤为重要。

　　目前，世界各国在严禁动物实验和推行替代方法法规上的认识逐渐统一，毫无疑问，替代方法在化妆品安全性评价中的使用已是大势所趋。我国对替代方法的研究起步较晚，材料及使用设备的提供暂时没有跟上，导致试验成本较高。虽然已经替代方法相关的国家标准出台，但是基本都是以OECD指南作为基础。随着化妆品法律法规体系的不断完善，相信行业对于安全性评价的需求会越来越大，替代方法作为安全评价的必要手段，未来可期。（何一凡   北京工商大学）

(责任编辑：姜秀平)