分子诊断学是利用分子生物学理论、技术和方法，来研究人体内源性或外源性生物大分子及其体系的存在与否及其结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据，从而为个体化医疗提供数据支持。分子诊断学技术主要分为分子杂交技术、聚合酶链式反应（PCR）技术以及基因测序技术等。由于分子诊断学技术在疾病诊断方面有快速、准确的优点，其在检验医学中具有重要地位。

基于核酸分子杂交技术的检测技术

核酸分子杂交技术是指不同来源的两条核酸单链在一定条件下，按照碱基互补配对原则形成双链的技术，主要包括荧光原位杂交技术（FISH）、菌落原位杂交技术、Northern印迹法、斑点杂交技术、芯片杂交技术、Southern印迹法等。

FISH技术是在人体的染色体、组织或者细胞上，将荧光素标记的探针按照碱基互补配对原则，使得靶基因得以显示。该技术问世以来，被迅速应用于检测各种类型的细胞遗传学的改变，包括染色体拷贝数异常等。同时，它也是临床疾病诊断的重要手段，如肿瘤检测、对染色体非整倍性异常引起的不孕不育检测等。

基因芯片利用原位合成或者显微点样技术，将很多DNA探针按照顺序固定在支持物的表面，然后与进行标记的样本进行杂交，并且将杂交后获取的信号进行分析，从而能够获得样品的基因排列顺序和基因表达等信息。根据不同的基因芯片制作方法，基因芯片可以被分为两大类，一类是原位合成的芯片，另一类是DNA微阵列。根据基因芯片上探针种类的不同，基因芯片还可以称作是寡核苷酸芯片、cDNA芯片、DNA芯片等。具有高密度特性的寡核苷酸芯片，主要采用的方法是原位合成，具有低密度特性的芯片采用的是点样方法，而cDNA芯片和DNA芯片只能采用点样的方法制成。由于基因芯片技术具有自动化程度高、操作简单、通量高等特点，在基因分型、基因表达、单核苷酸多态性检测等方面均有广泛应用。

基于PCR技术的检测技术

PCR是以DNA半保留复制机制为基础发展出的体外酶促合成、扩增特定核酸片段的一种方法，包括变性-退火-延伸三个基本反应步骤。由于PCR技术具有速度快、操作方便、灵敏度高、标本要求低以及特异性高等特点，在食品检验、医学、农学等领域被广泛应用。随着技术的发展，PCR技术已经衍生出很多不同的细分技术，例如实时荧光定量PCR、逆转录PCR、逆转录实时荧光定量PCR、数字PCR、多重PCR（也称复合PCR）、反向PCR等。

按照PCR技术的演进，人们将PCR技术划分为三代：普通PCR技术、实时荧光定量PCR和数字PCR。普通PCR技术是经典方法，国际和国内标准齐全，仪器试剂成本较低，用于定性分析；实时荧光定量PCR技术方法成熟，配套仪器试剂齐全，试剂成本中等，操作简单，检测敏感性高，特异性高，可实现半定量检测；数字PCR技术可以实现绝对定量，具有更高的敏感性和特异性，可以检测低拷贝样品，但该技术所用到的仪器设备和试剂价格昂贵，操作复杂，检测时间长。这三代PCR技术有各自的优缺点和应用领域，并不是一代取代一代的关系。PCR技术在临床检测中主要用于癌基因的检测和诊断及用药指导、致病病原体的检测、遗传病的产前诊断等方面。

基于基因测序技术的检测技术

基因测序是通过各种测序技术把基因的序列测出来，进而通过生物信息学分析对这些不同的序列进行解读。1977年由Sanger发明的DNA双脱氧链末端终止测序法，是第一代基因测序技术。该技术直到现在依然被广泛使用，但是该方法一次只能获得一条长度在700～1000个碱基的序列，无法满足现代科学发展对生物基因序列获取的迫切需求。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa和Hiseq技术及ABI公司的Solid技术为代表的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术也称高通量测序技术，相较于第一代测序，它可以实现大规模平行测序，具有检测用时短、灵敏度高、通量高等诸多优势，极大推动了分子诊断在临床检测方面的应用，也推进了基因组学的发展。第三代测序技术主要是以单分子测序及纳米孔测序为代表，如牛津大学的纳米测序技术、Pacific Biosciences公司的单分子实时测序技术（SMRT）等。与前两代相比，第三代测序技术的最大特点就是测序过程不需要进行PCR扩增。

目前，临床用第二代测序技术已经商业化，并逐渐走向成熟，国内外许多公司正积极开发和商业化更多临床实验室的应用产品。第二代测序技术在临床应用中的仪器设备复杂，检测试剂需要根据不同检测方法配制，技术操作难度较大，对操作人员技术能力要求高，对临床解读的水平要求也非常高。第三代测序读长较长，需要克服错误率、成本及样本要求较高以及算法、软件、数据库等配套的技术问题。第一代基因测序技术因成本高、通量低而限制了其在临床方面的应用，但由于准确率极高，因而被认为是基因测序的“金标准”。

基因测序技术近年来发展很快，应用日益广泛，在临床上主要应用于寻找疾病的候选基因，可用于单基因病、复杂疾病（如糖尿病、肥胖症等）甚至癌症致病基因或易感基因的寻找。同时，基因测序技术也极大地促进了胎儿游离DNA的实验室研究和无创性产前基因诊断的发展。

基于核酸质谱技术的检测技术

20世纪80年代出现的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）打破了质谱仅可进行小分子物质分析的传统，使得核酸、蛋白质等生物大分子也可应用质谱进行研究，极大推进了基因组学、蛋白质组学的发展，并且给生物领域及医学领域带来了革命性突破。

质谱技术的基本原理是通过样品离子化，产生不同质荷比的离子，然后再经过质量分析器测定该样品中不同种类离子的分子量，并按照从小到大的顺序依次排列，从而得到一幅质量图谱。由于核酸为极性、非易失性和热不稳定的生物大分子，且基于通量要求和样品制备的难度，目前核酸质谱主要使用的质谱技术为MALDI-TOF MS。MALDI为基质辅助激光解吸电离（matrix-assisted laser desorption ionization）的缩写。这是一种软电离方式的离子源，给样品能量较小，容易获得能指明相对分子质量的准分子离子，基本不产生碎片峰。TOF-MS为飞行时间分析器（time of flight analyzer，TOF analyzer），其作用为将离子源产生的离子按m/z顺序分开并排列成谱。

核酸质谱技术既具有PCR技术的高敏感性、模板浓度要求低特点，又具备高分辨率和阵列技术的高通量等特点，且直接利用质谱峰值定性定量测定，不需要化学发光、荧光法或其他任何二级标记方法，符合临床应用上的通量和灵敏度的需求，适合于复杂的、多靶标疾病的分子诊断，可应用于药物基因组学、病原体检测等领域。

基于CRISPR/Cas的检测技术

CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌的一种适应性免疫应答系统，通过体内小RNA对外来核酸进行序列特异性检测和沉默，从而阻止病毒、质粒等入侵。该系统发挥功能的过程主要包括适应、表达和干扰3个阶段。当病毒首次入侵时，细菌会将一小段病毒DNA整合到自身CRISPR基因的间隔序列中；当该病毒再次入侵时，之前整合的CRISPR转录生成成熟CRISPR序列（即crRNA），在crRNA引导下，Cas蛋白特异性识别并切割外源的基因组变为线性，使得病毒无法进行复制和表达，最终被细菌体内的酶降解。

CRISPR/Cas系统由两大部分组成。第一个部分是编码Cas相关蛋白质的基因，这些Cas蛋白在获得外源基因片段和剪切外源基因上都起着重要的作用。第二大部分被称为CRISPR array，这个部分中包含了Repeat序列和Spacer序列，这两种不同的序列是间隔开来的，两个Repeat序列夹一个Spacer序列。Repeat序列在同一细菌中的碱基组成和长度基本不变。根据Cas效应蛋白的结构和功能，CRISPR/Cas系统被分为两大类：Class 1（包含了typeⅠ、typeⅢ和typeⅣ）和Class 2（包含了typeⅡ、typeⅤ和typeⅥ）。在Class 1中，对于外源基因组的剪切需要一个大的Cas蛋白复合物和引导RNA。Class 2中，外源基因的剪切只需要一个单一的剪切蛋白。目前，基于CRISPR/ Cas系统的检测方法包括RNA引导的靶向识别系统（Cas9），以及靶向识别触发的附带裂解系统（Cas12和Cas13）。

根据检测原理，可将这些基于CRISPR/Cas系统的核酸检测技术分为两类：典型的靶向识别切割和非典型的非特异性反式切割。检测信号的方式主要包括四大类：基于荧光信号实时检测、基于裸眼比色检测、基于电化学检测和基于其他信号检测。其中，较常用的是基于荧光信号的检测方法，即在反应体系中使用末端带有荧光基团和荧光猝灭基团标记的单链DNA或单链RNA报告基因，当Cas效应蛋白和cr RNA复合物特异性识别切割目标基因后，会对报告基因进行非特异性切割，荧光素得以释放从而显示结果。

目前获批上市的产品有新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒（恒温CRISPR法）、新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒（CRISPR免疫层析法）等。

基于微流控技术的检测技术

微流控又被称为芯片实验室或微流控芯片技术。这种技术把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。

微流控芯片技术应用于核酸分子检测，可以将核酸提取、扩增及检测等基本操作单元集成到一块几平方厘米大小的芯片上，实现核酸分子的自动化检测。随着微流控芯片技术在临床检验诊断中的应用和发展，基于核酸分子检测的微流控产品也开始占领了部分市场。Cepheid公司在2005年发布的GeneXpert PCR分析仪将样品制备、扩增与检测完全整合，使得不具备专业技术的人员也可以在各种环境下进行复杂的分子检测，同时基于实时荧光定量PCR技术，可以在30分钟内完成检测。而GenePoc的Revogene系统以及博晖创新的GenPlex微流控全自动核酸检测系统将芯片设计成离心及阵列式微流控芯片，在单一芯片上可以进行多个项目的检测。

上文中提到的各检测技术在临床应用中都有各自的特点，均已在临床成功转化应用。随着我国人口老龄化的进程，癌症、慢性病等发病率会持续升高，同时国民健康意识也在逐渐提升。分子诊断技术将呈现快速且自动化趋势，以减少人工消耗、降低成本、缩短检测周期，以便更好地在临床应用。

（作者单位：国家药监局医疗器械技术审评检查大湾区分中心）

(责任编辑：周雨同)